□ 张 帆 陶 涛 王水明 文/图
“埃博拉病毒检测技术储备研究”建立的针对埃博拉病毒及其5种亚型的检测方法，为我国埃博拉病毒防控提供了第一手资料及技术手段，这将有助于我国对出入境贸易商品中携带EBV进行科学评价，对进出境人员、易感动物进出境的EBV预警防控提供必要的检测技术储备。
检测人员确认PCR是首选检测技术
实验人员对检测结果进行照相分析
技术人员制备被检样品
江苏南京检验检疫局主持的江苏检验检疫局科研项目“埃博拉病毒检测技术储备研究”近日顺利通过鉴定。鉴定会上，鉴定委员会听取了课题组的研究工作汇报，审阅相关材料并进行了质询，经评议后一致认为，课题组建立的针对埃博拉病毒及其5种亚型的检测方法，具有良好的敏感性、稳定性和重复性，对外来病防控和出入境动物产品检验检疫具有重要意义，应用前景广阔，其成果达到国际先进水平。
技术储备 刻不容缓
埃博拉出血热（Ebola haemorrhagic fever，EHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBV）引起的急性多器官溶血性疾病，属于动物疫源性传染病，人的病死率高达80％，是人类目前已知最为烈性的传染病之一。由于该病最初是在苏丹和扎伊尔间的埃博拉河流域发生，故称为埃博拉血热。
EBV通过干扰感染者机体凝血平衡，导致血管壁破坏或功能受损，血小板不能凝血，在2至21天内出现出血性休克或器官衰竭。人感染EBV，主要表现为急性发热、肌肉酸痛、头痛、呕吐；有出血趋势和偶尔的休克症状，皮肤丘疹，胃肠道、呼吸道和器官瘀血、出血。由于体内器官坏死、分解，病人不断把坏死组织从口中呕出，最后多因广泛性内出血、脑部受损等原因而死亡，世界卫生组织已将EBV列为对人类危害最严重的病毒之一。
由于EBV危害程度分类为第一类，其病毒培养、动物感染等试验必须在生物安全四级实验室进行，未经培养的感染材料在生物安全三级实验室，灭活材料在生物安全二级实验室进行。世界上仅有少数几个国家的实验室能开展埃博拉病毒的研究，主要集中在美国亚特兰大的CDC。我国在埃博拉出血热的检测研究上还基本上属于空白。
虽然目前我国境内并没有出现EHF的暴发，也不存在EBV。但是由于我国与外国贸易往来不断增多，尤其是与非洲各国的交往比以往更为频繁，EBV极有可能通过潜伏期病人或者隐性感染者以及感染的动物传入我国。EHF若暴发将带来难以估计的危害。加快EBV检测技术的储备，建立快速、准确、特异的EBV实验室检测方法，对于口岸卫生检疫、动物及动物产品检疫具有重要意义。检测技术储备，刻不容缓！
攻坚克难 创造领先
得到免疫性良好检测抗原，避免使用全病毒所带来的巨大风险，首先要制备检测抗原。在EBV核酸检测时，一般选择高度保守糖蛋白（GP）或核蛋白（NP）作为扩增靶标进行设计引物或探针，课题组正是在EBV NP序列的5'端非编码区的一段高度保守的序列进行引物设计，实验结果表明具有很高的特异性。由于我国现在还没有感染EBV的临床样品，并严禁EBV的操作，课题组创新性地采用体外合成的办法获得目的基因，采用基因掺入法制备被检样品，并模拟样品病毒灭活过程。
选择适合我国情况的检测方法。国外报道建立对EBV的多种检测方法，如病毒分离、电镜观察、RT-PCR、Real-time PCR、PCR、ELISA、捕捉ELISA、血凝试验、间接免疫荧光、Western blot等，从现场应用结果来看，RT-PCR方法具有快速、敏感的优点，结合我国实际情况，PCR仍是最理想的首选检测技术。
EBV与多种出血热病毒有较近亲缘性，尤其是马尔堡病毒（Marburg Virus，MARV）同属丝状病毒属。为了攻克这一难关，研究小组在EBV NP序列的5'端非编码区的一段高度保守的序列进行引物设计，采用特异性较强的套式PCR方法，在经历上百次失败后，成功设计出合适的引物，进而经过反复摸索，优化反应条件，最终成功建立套式RT-PCR方法。该项方法不仅具有良好特异性，能区分EBV和MARV，而且具有高敏感性，可以检测10pg的病毒RNA，将检测敏感度提高了1000倍。
病毒亚型之间的同源性远远高于不同病毒之间，即使是国际上，目前也仅能对EBV的扎伊尔亚型、苏丹亚型和本迪布焦亚型三种亚型进行区分，尚无检测莱斯顿亚型和科特迪瓦亚型方法的报道。研究组明知山有虎，偏向虎山行。在吸收国外成功经验的基础上，结合掌握的资料和前期的经验，采用Taqman Real-time RT-PCR技术，成功建立了分别检测5种亚型的检测方法，其中对莱斯顿亚型和科特迪瓦亚型的检测方法为国际首创。这一研究成果，不仅填补了国内外的研究空白，也具有重要的应用价值，对于疾病的治疗、病原的追溯、疾病的防控具有重要意义。
成果初现 走向应用
课题组利用建立的检测方法，对缅甸地区两个县，涉及3个科，5个属的853只蝙蝠进行了荧光定量EBV检测，结果全部阴性；共收集全国15个省（市、区）猪临床样品920份，被采集临床样品的猪都表现出猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪流感或猪流行性腹泻病疑似症状，对这些样品进行了EBV RT-PCR检测和莱斯顿亚型EBV检测，结果全部为阴性。通过临床样品的检测，一方面验证了检测方法的稳定性和重复性，另一方面，这是国内首次针对EBV的流行病学调查，这为我国EBV的防控提供了第一手资料。
课题组在研究过程中，发表研究论文10篇，研究的“一种检测埃博拉病毒的荧光定量PCR检测方法及其引物和试剂盒”和“一步法检测Z/S亚型埃博拉病毒的实时荧光定量RT-PCR方法及其试剂盒”申请国家发明专利，目前已成功受理。
该项目研究的5种亚型EBV的RT-PCR检测方法、SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法及单独检测每一基因亚型的EBV荧光定量RT-PCR检测方法适用于大规模EBV流行病学调查，具有简单、快速、敏感的优点，将为进出口动物检疫，EBV易感动物监测提供简单、快捷的检测工具。
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（Ebola virus）又译作伊波拉病毒，是一种能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病病毒。埃博拉病毒的名称出自非洲扎伊尔的“埃博拉河”。
这种病毒来自“Filoviridae”族，与马尔堡病毒类似。“埃博拉”病毒是一种十分罕见的病毒，这种病毒最早是于1967年在德国的马尔堡首次发现的，但当时并没有引起人们的注意。1976年在苏丹南部和扎伊尔即现在的刚果（金）的埃博拉河地区再次发现它的存在后，才引起医学界的广泛关注和重视，“埃博拉”由此而得名。在大约1500例确诊的埃博拉案例中，死亡率高达88%。目前没有有效的特效疗法，也没有埃博拉病毒的疫苗。
《中国国门时报》
